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曲曉剛研究員，最新Nature Catalysis！

成果簡介

生物正交化學（Bioorthogonal chemistry）原位生成治療劑為疾病治療提供了新的途徑，但是走向實際應用，必須考慮兩個關鍵問題：一是防止原位合成藥物分子的代謝失活；二是提高生物正交催化劑的生物相容性和腫瘤細胞選擇性。

基于此，中國科學院長春應用化學研究所曲曉剛研究員（通訊作者）等人報道了一個基于生物相容性氫鍵有機骨架（HOF）的雙前藥活化平臺（Apt@E-F@PHOF-1），實現腫瘤微環境響應雙前藥生物正交激活策略，并選擇抗癌藥物5-氟尿嘧啶（5FU）和二氫嘧啶脫氫酶（DPD）抑制劑5-乙炔基尿嘧啶（5EU）作為模型雙藥物。

在該策略中，作者首先設計了一種由Fe(III)中四(4-羧基苯基)卟啉氯（FeTCPP）組成的生物相容性鐵卟啉生物正交預催化劑（即PHOF-1）。

然后，將5FU前藥（pro-5FU）和5EU前藥（pro-5EU）原位封裝到PHOF-1中，最后在PHOF-1表面修飾AS1411適體以靶向攻擊癌細胞的核素。PHOF-1既是生物正交預催化劑，也是抗癌前藥pro-5FU和pro-5EU的載體。

該生物正交體系具有以下優點：（1）雙藥同時激活可以增加5FU的生物利用度，維持5FU的長期高濃度，從而有效化療，因為5EU通過抑制DPD酶有效阻止5FU失活；（2）適體靶向和GSH觸發的衰老是確保腫瘤選擇性前藥精確激活和避免過早釋放和清除的雙重保障；（3）HOF-基設計使該生物正交平臺具有良好的生物相容性。它是HOF基生物正交前藥激活的首個例子，提出了一種有前途的方法來增強腫瘤抑制和減少治療副作用。

圖1. HOF-基生物正交前藥激活用于化療

研究背景

生物正交化學在生物學和生物醫學領域具有獨特的應用潛力，通過生物正交反應激活前藥是降低藥物毒性和減輕藥物不良反應的一種很有前景的方法。

盡管在這一領域取得了一些成就，但在實際應用中必須考慮兩個關鍵問題：（1）如何防止藥物失活，這是導致臨床療效不理想的關鍵因素；（2）如何提高生物正交催化劑的生物相容性和腫瘤細胞選擇性。大多數生物正交催化劑在未經改性的情況下，通常表現出較差的生物相容性和選擇性，從而限制了它們在生物醫學和生物醫學上的應用。

最近報道了一種新的生物正交預催化劑鐵卟啉，它可以在谷胱甘肽（GSH）等巰基存在下催化疊氮化物還原為氨基。鑒于腫瘤細胞中GSH濃度高于正常細胞，鐵卟啉基生物正交催化劑可通過GSH觸發的生物正交反應來保證腫瘤的選擇性。

然而，鐵卟啉受其生物相容性的限制。氫鍵有機骨架（HOF）是一種新型的多孔晶體固體，具有生物相容性好、合成簡單、毒性低等優點，已成功應用于蛋白質或細胞的包封、藥物傳遞、生物傳感、抗生素和疾病治療等領域。

圖文導讀

合成與表征

作者選擇了FeTCPP作為構建單元，在室溫條件下，在乙醇-H₂O水溶液中合成卟啉HOF（PHOF-1），并制備了納米級的PHOF-1。

具體而言，兩個FeTCPP分子通過橋接O原子連接形成結構單元μ-O-[FeTCPP]₂，它們面對面交錯形成輪式結構。每個結構單元被另外6個結構單元包圍，每個結構單元平均產生4個氫鍵。H???O氫鍵體系（H???O）有兩種類型的氫鍵，分別為1.7 ?和1.8 ?，O – H???O的角度分別為161.4°和155.7°。在結構單元μ-O-[FeTCPP]₂中，Fe-Fe距離為3.5 ?，Fe-O距離為1.761 ?，Fe-O-Fe角為178.32°。此外，作者通過原位合成實現了將pro-5FU和pro-5EU封裝到PHOF-1（E-F@PHOF-1）中。

圖2. PHOF-1的晶體結構

圖3. HOF-基生物正交催化劑的表征

體外催化性能

Apt@PHOF-1的催化能力源于其鐵卟啉（Fe-por）單元，它可在生物硫醇存在下催化芳基疊氮化物還原為相應的胺。簡而言之，在GSH將Fe^III還原為活性Fe^II后，疊氮化物底物與Fe-por結合并生成初始疊氮化物-Fe-por配合物，該配合物隨后經過N₂的損失生成亞氮-Fe^IV中間體，并在另一個GSH催化下生成氨基產物。

當Apt@PHOF-1在GSH存在下催化時，母體香豆素被釋放，熒光恢復。在Apt@PHOF-1和GSH分別存在下，香豆素前體的熒光變化不明顯，而Apt@PHOF-1和GSH共存時，樣品熒光顯著增加，表明GSH在Apt@PHOF-1介導的催化反應中起著至關重要的作用。

圖4. Apt@PHOF-1體外催化性能

細胞和動物實驗

RAW264.7作為正常細胞，RAW264.7細胞裂解液的GSH濃度比HCT116低十倍以上。共聚焦顯微鏡結果顯示，僅在Apt@PHOF-1和原香豆素處理的HCT116細胞中，由于Apt@PHOF-1在谷胱甘肽的幫助下有效地降解了原香豆素，觀察到較強的藍色熒光，而RAW264.7未見明顯熒光。

同時，pro-Rh110活化的共聚焦顯微鏡和流式細胞術研究結果與香豆素原活化的結論相同。細胞裂解液的LC-MS分析表明，5FU和5EU在HCT116細胞中都被成功激活，而在RAW264.7細胞中幾乎沒有檢測到5FU或5EU，表明該策略進行腫瘤選擇性前藥激活的可行性。

圖5. Apt@PHOF-1在細胞中催化性能

Apt@PHOF-1即使在100 μg ml^?1的高濃度下，HCT116和RAW264.7細胞存活率仍保持在90%以上，表明其具有良好的生物相容性。對比5FU，5FU與5EU以1: 1摩爾比混合表現出更強的抑制效果。

5FU的IC₅₀值為47.2 μM，5FU與5EU混合后的IC₅₀變為0.622 μM。根據殺傷曲線，選擇10 μM為最佳給藥濃度，最終給藥劑量為50 μg ml^?1。Apt@PHOF-1和Apt@F@PHOF-1對HCT116的增殖抑制率分別為15.69%和60.26%，Apt@E-F@PHOF-1對HCT116的增殖抑制率高達87.27%。

圖6. HOF-基生物正交催化劑的細胞殺傷性能

利用cy3吸附的Apt@PHOF-1納米顆粒處理12 小時的小鼠，其腫瘤熒光比cy3吸附的PHOF-1更強，因為AS1411適配體的修飾。在治療14天后，注射Apt@E-F@PHOF-1（IV組）的小鼠腫瘤生長明顯受到抑制，而在I組和II組沒有觀察到明顯的抗癌作用，所有小鼠的體重波動都可以忽略不計。Apt@F@PHOF-1（III組）的中等治療效果可能是由DPD介導的5FU分解代謝引起。

腫瘤組織的H&E染色和末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP Ni-端標記（TUNEL）實驗，表明Apt@E-F@PHOF-1可通過增強化療來促進癌細胞凋亡。

圖7. 動物實驗

文獻信息

Hydrogen-bonded organic framework-based bioorthogonal catalysis prevents drug metabolic inactivation. Nature Catalysis., 2023, DOI: 10.1038/s41929-023-00999-0.

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