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研究背景

隨著對生物膜電生理學的深入研究，科學家對電壓門控鈉（Nav）通道的結構和功能關系產生了廣泛的興趣。Nav通道在調節神經元和肌肉細胞的膜興奮性中起著關鍵作用，對于產生和傳導行動電位至關重要。Nav通道的結構和功能異常與多種疾病，如癲癇、心律失常和疼痛障礙等病理狀態密切相關。因此，對Nav通道的深入理解不僅對于基礎科學研究，也對于疾病治療和藥物開發具有重要意義。然而，Nav通道的結構和功能之間的關系以及與不同功能狀態相關的構象仍然不清楚。尤其是在Nav通道的電機械耦合過程中，即在膜電位變化導致通道構象轉變的機制中存在很多未知之處。此外，盡管已經報道了幾種Nav通道的結構，但多數情況下這些結構代表了一種失活狀態，缺乏不同功能狀態下的結構信息。

為了解決這些問題，清華大學/深圳醫學科學院顏寧團隊在PNAS在線發表“Dissection of the structure–function relationship of Nav channels”的研究成果，她們采用了多種策略，其中包括通過引入點突變來改變Nav通道的結構，以及引入狀態依賴性的毒素或藥物來調控Nav通道的功能。通過這些方法，研究人員試圖獲取Nav通道在不同功能狀態下的結構信息，以更全面地理解Nav通道的結構與功能關系。本研究旨在深入探究人類Nav1.7通道的結構與功能之間的關系。通過系統地引入突變并解析這些突變體的結構，研究人員試圖揭示不同構象與Nav通道功能狀態之間的聯系，特別是在通道的激活和失活過程中。通過這些結構分析，研究人員解決了Nav通道在不同功能狀態下的結構特征，并提供了對Nav通道電機械耦合過程的新見解。

圖文導讀

為了揭示Nav1.7通道的結構與功能關系，研究者進行了合理設計的突變體研究。在該研究中，通過將人類Nav1.7通道的九個突變位點替換為NavPaS的相應殘基，生成了Nav1.7-M9突變體，該突變體具有更緊密的孔道結構和完全關閉的門。通過與WT和M11結構的比較，研究者發現Nav1.7-M9的整體構象介于WT和M11之間，其PD與M11相似，而VSDI和VSDII與WT相似。這表明Nav1.7-M9突變體的結構介于激活態和靜息態之間，具有重要的結構和功能特征。此外，通過HOLE計算發現，Nav1.7-M9的孔道收縮點半徑與M11幾乎相同，比WT窄約1.5 ?。這一發現與先前的分析結果一致，即在窗口中引入較大的疏水殘基會增加開放孔道的能量壁壘（見圖1）。

圖1. 我們對Nav1.7變異體的理性設計概述

為了研究Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之間的結構差異，研究者在圖2A中發現盡管M9和WT之間的VSDs在整體上相似，但VSDI和VSDII存在輕微的構象偏離。具體而言，M9中的VSDI呈現向上的構象，而VSDII完全向上。在圖2B中，研究者觀察到PD之間的結構偏差。在M9中，S6II和S6IV段經歷了從α到π的轉變，導致了S4-5II、S6II和S6III的協同運動，以及S4-5I與相鄰的S4-5II和S5II之間的協調運動。這些發現表明，盡管M9和WT之間的VSDs保持了相似性，但其PD之間存在顯著的構象變化。這些結構差異的發現為我們深入理解Nav1.7通道的結構與功能關系提供了重要線索，有助于揭示其電機械耦合的分子機制。

圖2. Nav1.7-M9和Nav1.7-WT之間的結構差異

研究者為了進一步探究Nav1.7通道的結構與功能之間的關系，進行了對Nav1.7-M9和Nav1.7-WT的結構比較與突變分析。圖3分為三個部分（A、B、C），展示了對Nav1.7通道突變體的生物物理特性和結構構象的詳細研究。在圖3A中，研究者首先進行了對PD突變的合理性分析，發現Nav1.7中的九個突變足以將PD鎖定在緊密的構象中。進一步的突變分析表明，PD上半部分的突變并沒有改變主鏈的位置，而下半部分的突變導致了明顯的結構變化，這對理解PD構象的微小差異提供了關鍵信息。在圖3B中，研究者展示了額外Nav1.7突變體的電生理特性。他們觀察到單點突變L866F或G1454C導致激活電壓依賴性曲線右移，而T870M導致左移。當將L866F和G1454C組合在一起時，激活曲線進一步右移。這些結果揭示了突變對Nav1.7通道電生理特性的影響，為進一步理解Nav通道的功能提供了重要線索。在圖3C中，研究者展示了Nav1.7-M2和Nav1.7-M4的結構分析結果。通過電子顯微鏡分析，他們發現這兩個突變體的結構幾乎與WT相同，盡管含有額外的突變。這表明，盡管VSD突變可能引起結構變化，但它們不會改變PD的構象，這對于理解Nav通道的整體結構具有重要意義。

圖3. 兩個Nav1.7變體的構象與WT相同

研究者通過圖4展示了Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的結構異質性增加情況。在圖4A中，研究者通過比較不同構象下的粒子選擇百分位，發現M9和M11相比M2和M4具有更高的結構異質性。這表明在缺乏任何膜電位的條件下，這兩種突變體具有更大的結構靈活性。進一步觀察3D電鏡地圖，研究者發現突變數目的增加與S6片段的α → π轉變（或者說PD的收緊）相關聯（圖4B）。在WT中，S6II和S6IV僅由α螺旋轉組成。而在M9和M11中，這兩者都在中間螺旋轉進行了α → π轉變。而對于M2和M4，盡管我們將S6IV建模為α螺旋轉，但局部密度的模糊性表明存在另一種構象，與存在門控調節劑毒素Huwentoxin IV（HWTX-IV）或Protoxin II時Nav1.7的3D重建中看到的情況類似。這些結果表明，突變體的結構異質性與PD的收緊以及S6段的α → π轉變密切相關（見圖4）。

圖4. Nav1.7-M9和Nav1.7-M11的構象異質性增加

研究者在圖5中展示了Nav通道的PD的結構-功能關系。圖5A展示了PD的三種解析狀態：放松、中間和緊密。放松的PD具有四個窗孔和類固醇樣分子穿透的特征，而緊密的PD則具有封閉的細胞內門和縮小的或封閉的窗孔。圖5B展示了非導電PD可能對應的多種構象，其中M9和M11顯示了緊密PD，而WT則顯示了放松的PD。通過比較Nav1.7-M9、M11、WT和HS-π的PD孔徑，揭示了PD的多種構象。圖5C預測了未來可能被結構解析的Nav變異體的電生理特性。具有右移的激活曲線和進一步右移的靜態失活曲線的變體可能代表靜息態構象。這些發現對于理解Nav通道的結構和功能之間的關系以及揭示靜息態構象的建模具有重要意義。

圖5. Nav通道PD的結構-功能關系

結論與展望

本文揭示了電壓門控離子通道（VGICs）結構與功能之間的關系，特別是鈉離子通道（Nav）的結構動態性如何影響其生理活性。通過系統的結構分析和電生理實驗，研究人員發現不同Nav通道變體在結構上的微小差異會導致電生理特性的顯著變化，這對于理解離子通道的活動機制至關重要。

此外，研究者們提出了一種通過結構解析Nav通道不同狀態的方法，進一步揭示了Nav通道的工作周期，特別是其靜息狀態的結構特征。這些發現不僅為了解生物膜電位調控和神經傳導提供了重要線索，還為設計更精確的離子通道藥物靶點提供了理論基礎。因此，本研究為進一步探索離子通道的結構與功能之間的關系以及神經元興奮性調控的分子機制提供了重要的科學啟示。

原文詳情：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2322899121

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