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研究背景

Iminium催化是有機催化中一種重要的反應機制，通過形成Schiff堿中間體，能夠有效地加速多種反應，尤其是在Diels-Alder反應中展現了巨大的潛力。然而，在天然酶中，Iminium催化的應用尚未被廣泛報道。Diels-Alder反應作為一種經典的[4+2]環加成反應，在復雜天然產物的合成中具有重要作用。盡管許多天然Diels-Alder酶已被發現并進行了研究，絕大多數都通過氫鍵催化或形狀互補機制來加速反應，這些酶的催化機制普遍未涉及Iminium中間體。在有機化學領域，Iminium催化已經被廣泛應用于各種環加成反應，尤其是在合成復雜分子時表現出色。然而，這種催化機制在生物催化中的研究仍然相對較少。自然界中是否存在利用Iminium催化機制加速Diels-Alder反應的天然酶，仍然是一個未解之謎。

成果簡介

基于此，加利福尼亞大學洛杉磯分校唐奕教授和K. N. Houk教授、中國科學院深圳先進技術研究院周佳海研究員等人合作提出了SdnG催化Diels-Alder反應的策略，實現了酶催化反應速率的顯著提升。該研究以“Iminium catalysis in natural Diels–Alderase”為題，發表在《Nature Catalysis》期刊上。

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作者簡介

唐奕教授，本科畢業于賓夕法尼亞州立大學，在David A. Tirrell教授的指導下完成博士學業，在Chaitan Khosla教授的指導下完成了博士后的工作。他目前是加利福尼亞大學洛杉磯分校化學與生物分子工程系的校長教授。他獲得的獎項包括美國化學工程師協會（AIChE）Allan P. Colburn獎（2009年）、美國化學學會（ACS）生物化學技術分會（BIOT）青年研究員獎（2011年）、ACS Arthur C. Cope學者獎（2012年）、EPA總統綠色化學挑戰獎（2012年）、NIH DP1主任先鋒獎（2012年）、ACS Eli Lilly生物化學獎（2014年）和工業微生物學和生物技術學會Charles Thom獎(2019)。在Nature、Science、Nature Chemical Biology、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Intl. Ed. 、PNAS等高水平專業期刊上發表論文100余篇，H指數46，引用次數1W+。

研究亮點

1、本文首次揭示了天然Diels-Alder酶SdnG通過Iminium催化加速Diels-Alder反應的機制，為理解自然界中的Iminium催化提供了新的視角。

2、通過X射線晶體學和計算模擬，研究表明SdnG的活性位點賴氨酸（K127）與底物形成Schiff堿中間體，從而促進Diels-Alder反應的發生。

3、該研究不僅揭示了天然酶的獨特催化機制，還為未來設計Iminium催化的生物催化劑提供了理論基礎，具有廣泛的工程應用前景。

圖文導讀

圖1 SdnG催化的Diels-Alder反應中的Iminium催化機制

圖1展示了SdnG催化的Diels-Alder反應中的Iminium催化機制。圖中詳細說明了酶SdnG如何通過與底物的反應形成Iminium中間體，從而促進Diels-Alder反應。SdnG通過賴氨酸K127殘基與底物中的醛基形成Schiff堿中間體（Iminium）。該反應路徑通過計算和實驗方法得到了驗證，并且展示了Iminium催化反應如何通過降低過渡態能量（ΔG?）來加速反應。在該圖的結構示意中，顯示了賴氨酸K127如何與底物的醛基發生親核攻擊，形成具有增強電子親和力的中間體，進而大幅度降低過渡態的能量。這一過程的最大特點是通過氨基酸殘基的空間位置和電荷分布，SdnG催化的反應速率得到了約560倍的提升。圖中還展示了計算模擬得到的過渡態能量變化，證明了Iminium中間體相較于其他反應中間體更有助于反應的快速進行，進一步揭示了賴氨酸在催化過程中所起的核心作用。

圖2 SdnG與底物3和產物4的晶體結構

圖2展示了SdnG與底物類似物3的晶體結構，通過高分辨率的X射線晶體學數據進一步驗證了Iminium催化機制的可行性。圖中詳細描繪了SdnG酶的整體結構以及底物類似物3在酶的活性位點中的結合方式。圖中的SdnG蛋白呈二聚體結構，其中每個亞單位的活性位點能夠與底物3結合。特別是在底物結合的部分，圖中顯示了賴氨酸K127與底物的醛基之間的電荷相互作用，幫助底物精確地定位到反應所需的構象。底物類似物3的結合方式揭示了SdnG如何通過多種相互作用（例如氫鍵、靜電作用等）保持底物的穩定性，同時使其處于理想的反應構象。通過進一步分析，圖2揭示了SdnG酶的活性位點內有多個氨基酸殘基與底物進行相互作用，增強了酶與底物之間的親和力并促進了反應的發生。

圖3 亞氨基在SdnG中催化作用的生化證據

圖3展示了通過生化實驗驗證Iminium催化機制的證據。該圖通過質譜分析和突變體研究進一步確認了賴氨酸K127在SdnG催化中的關鍵作用。圖中的實驗數據表明，當SdnG的K127位點被突變為Ala（K127A）時，酶的催化活性顯著下降，表明K127的存在對催化反應至關重要。此外，通過與底物3和產物4的相互作用，圖中展示了如何利用NaBH₄還原中間體，進一步捕捉并穩定Iminium中間體。質譜分析結果清晰地顯示，K127突變體未能形成預期的Iminium中間體，而野生型酶則能夠有效地與底物形成Schiff堿中間體。通過這一實驗，研究人員不僅驗證了賴氨酸K127在Iminium催化中的角色，還揭示了酶催化反應中的關鍵中間體。圖3還進一步展示了突變體在不同條件下的催化活性，突變K127的酶幾乎失去了對Diels-Alder反應的催化能力，證明了賴氨酸殘基在催化反應中起著無可替代的作用。

圖4 SdnG的作用機制

圖4 展示了SdnG催化Diels-Alder反應的作用機制。圖中基于計算模擬與實驗數據，提出了一種全新的催化機制，闡明了SdnG如何利用賴氨酸K127形成Iminium中間體來降低過渡態能量，從而加速反應。圖4通過展示SdnG與底物及產物之間的相互作用，提出了一個具體的反應路徑，其中Iminium中間體在反應過程中扮演了重要角色。圖中詳細分析了通過氫鍵網絡和酶的活性位點形成的催化環境，如何有效地促進底物的定位和反應的順利進行。通過對比其他催化機制，圖4強調了Iminium催化相較于其他機制具有更低的過渡態能量，進而顯著提高了反應速率。研究人員通過密度泛函理論（DFT）計算，揭示了通過賴氨酸K127和底物形成Iminium中間體能夠有效降低過渡態的能量，為反應的快速進行提供了條件。

總結展望

本研究不僅揭示了SdnG在催化Diels-Alder反應中的新機制，還為未來設計基于Iminium催化的生物催化劑提供了理論依據。通過深入的結構和計算分析，研究表明SdnG利用賴氨酸殘基形成Iminium中間體，顯著加速了反應速率。這一發現為進一步理解自然界中的酶催化機制提供了新的思路，并為生物催化劑的設計和優化提供了新的方向。此外，本文還展示了如何將這一催化策略擴展到其他反應類型，為開發更為高效和可持續的催化方法提供了可能。

文獻信息

Iminium catalysis in natural Diels–Alderase. Nature Catalysis

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